微生物实验报告：水中细菌总数和大肠菌群的检测（优秀5篇）

微生物实验报告：水中细菌总数和大肠菌群的检测 篇一

实验六 水中细菌总数和大肠菌群的检测

摘 要：本实验以测定公园河流水的细菌总数和大肠菌群的数量，来测定特定地点的水质情况。初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标，判定水体的质量。对该实验点的水源作出了定性的评价，以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。关键字：河流水；细菌总数测定；大肠菌群；EMB培养

前言

各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g(mL)]，可用稀释平板计数法检测。水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。

特征：G-无芽孢杆菌，兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。多管发酵法

初发酵：适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气；

分离培养：伊红美蓝（EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落； 复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。

材料和方法

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定

牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5.0 g，琼脂8g，蒸馏水1000ml； pH 7.0 乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵

1×：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL（调pH值后加）、水

1000mL、pH 7.2－7.4 三倍浓缩液（3×）：除水以外，其余成分取三倍用量

分装：1×的培养基分装9ml/管，3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。灭菌条件：115℃，15min。

EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定

脱水培养基，按说明书操作，水用量为90%。水源：紫竹院河水

仪器： 高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。

试剂 ： 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂

具体实验步骤： 1），相关器械的灭菌操作，以及前往紫竹院取少量的样品水。2），按照上述的配料，无菌操作配置培养基。

-1-2-33），细菌总数的测定：取上述样品水，一次稀释10,10,10,3个浓度。对于每个浓度，取1ml稀释液加入冷却好的牛肉膏蛋白胨培养基中，立即混匀，每个浓度重复一次。将平皿倒置培养在37℃的温箱24h，计算平皿的细菌总数。4），大肠菌群的测定：将样品水稀释成10,10,10,3个梯度。

实验结果与数据分析 1，细菌菌落总数

稀释浓度及菌落数

组别 1 2 平均 10 12 4 8-1-2-30-1-

210 0 0 0 0 0 0

平板菌落状况 报告方式选取 最低稀释度下菌落数 × 稀释倍数

菌落总数（cfug ， cfu/ml

均小于30

8.0×10

2,大肠菌群总数

实验结果 产酸 产气 紫黑色

EMB 粉红色

革兰-G 氏染

色

结论 阳性管数 初发酵 + + + 原溶液 + + + + + +

+ + +

+ + +

+ + + +

+

+

+ + +

+

0

0

3，EMB 数据值计算 查表可得，MPN=MPN指数10ml

接种量最大的一管的水样ml接种量最大的管：1ml

每100ml水样中菌数最大可能值：230

95%可信限值

上限：700

下限：70 水样的分析得出这样的结果：细菌总数：80个/mL

大肠菌群数：2300个/L

大肠菌群数占细菌总数：2.88%。

根据我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85规定 细菌总数不超过100个，已达标。大肠菌群不得超过1000个，超标。

经过严格的消毒处理，大肠杆菌不超过10000个，水样达标。

结论：从上述的水样分析，我们可以得出此处的河流水污染不是很严重，作为景观水，已经达到了标准，但是此类水是不能作为饮用水的，可能存在一些粪便的污染，导致大肠菌群的数量过高，倘若经过严格的消毒灭菌，才能饮用。

实验讨论：

1，大肠菌群的定义是什么？、为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。而由于大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。大量的调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，而且人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。所以大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。

2，EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？

EMB培养基主要包含以下几种物质：蛋白胨，乳糖，蔗糖，磷酸二氢钾，伊红Y，美蓝，蒸馏水。EMB培养基的机制就是靠微生物在发酵过程中，使培养基发生分解，产生大量的氢离子，从而改变培养基的PH，由于提前添加的指示剂，在PH值的改变下，就会发生颜色的变化，从而鉴定生长的菌种。在检测大肠菌群的时候，蛋白胨提供了氮源，磷酸二氢钾提供了磷元素和钾元素，实验应注意的问题以及改进： 1，样品的问题

由于本实验是一个检测的实验，存在一个严格灭菌的过程。从采样，到最后的分析，整个过程不仅不能让其他杂菌污染，而且还得保证样品中本身细菌的总数基本不损失。1），采样的器械必须是经过严格灭菌的，而且其本身的构造不会对微生物的生存造成威胁。2），由于样品会处于密闭的过程，水中的含氧量会慢慢降低，所以对样品的处理应该尽快处理。3），对于样品的稀释不应该用蒸馏水，而应该用灭菌的生理盐水，防止细菌吸水裂解死亡。4），整个接种的操作必须正确，不能杀死细菌，或者引入其他杂菌。2，关于梯度重复的问题

本实验设计到一个很关键的问题，那就是梯度重复。对于一个梯度的实验量的统计和处理，我们常常采用重复，来解决其实验误差所造成的影响，但有些时候重复增加了大量的工作量，却没有根本提高实验的准确性，仅以本实验为例。在对细菌数量测定时候，我们每个梯度设置了2个重复，在事实上，第一个梯度的准确性很高，但是在最后一个梯度，可能存在很大的误差。在对一个样品进行定量分析的时候，我们往往要考虑很多干扰它的因数。假定我们所取的样品现在要进行一个梯度的稀释后取样，当前浓度为c，取样的体积为v，那么假定单位体积内只存在一个细菌，则可以建立如下的数学模型：

wxnixnxaixcv,xixaip,aipkcvcvcv

kaivcn从模型中，我们可以得到最终的表达式：w，ainvcaivc，当取样体积和梯度恒定的时候，我们不难发现，增大取样的重复数，可以提高实验的精确度，但是当c足够大的时候，分子本身就会变得无限小，而分母的一次增量远不如多次的。同理，当c很小的时候，分子变得很大，分母变得很小，这个时候不增加次数，或者调解取样体积，会造成很高的实验误差，所以，本实验的三个精度变量就是梯度，取样体积，梯度重复数。鉴于对本实验的最后分析，我们觉得，在后两个梯度有必要增加重复数，虽然增加了工作量，但是可以有效避免较大的实验误差带来的干扰。同样，在对其他的实验样品处理过程中，原始浓度一般只需要2个重复，随着数量级的增加，其重复的次数也应该发生变化，不应该不-3-5变，诸如在在10，设置4个重复，而10时候，可以设置8个重复，这样可以在追求最简工作量的时候，获得最简的实验结果。

参考文献：

[1] 王玉兰。环境微生物学实验方法与技术。北京，化学工业出版社。2009,3.[2] 陈坚。环境微生物实验技术。北京：化学工业出版社，2008 [3] 钱存柔。微生物学实验教程（第二版）。北京：北京大学出版社，2008 [4] 周德庆。微生物学教程（第二版）。北京：高等教育出版社，2002,5.[5] 沈萍。微生物学。北京：高等教育出版社，2000.[6] 徐全智，杨晋浩。数学建模（第二版）。北京：高等教育出版社，2008.

微生物实验报告 篇二

微生物实验报告

姓名：阿曼古丽

学号：09070401042

班级：生物科学08-班

微生物实验课程已经接近尾声，同时训练我们实际动手能力的实验课程也已经全部结束，通过自己切身动手设计，操作实验，感到收获颇多。

我觉得最重要的就是实验过程中操作实验的重要性。实验操作可以说是实验成功与否的关键部分，可是马虎不得。对于需要团队合作的实验，个人认为要有强势的人员搭档，不说是精通实验操作规程，最少也得知道实验的基本操作，掌握要做实验的基本放法，这对于后续的实验无疑是有决定性作用的。对于个人的实验能力，关键还是要看平时的实验积累，有些实验操作繁琐复杂，需要极大的耐心，这些都应该是逐渐培养起来的。

在这里我以学过的几个实验为例，简单谈一下自己的心得体会。

（一）环境因素对微生物生长的影响

温度对微生物学报的大分子（蛋白质、核酸等）稳定性、酶的活性、细胞膜的流动性和完整性等方面有重要的影响。过高温度会导致蛋白质（酶）及核酸变性失活，细胞膜破坏等，而过低温度会使酶活性受抑制，细胞新陈代谢活动减弱

pH值过高或过低会使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，影响其生物活性，甚至导致变性失活，还可以引起细胞膜电荷变化，影响学报对营养物质的吸收，同时还会改变环境中物质的可给性及有害物质的毒性。紫外线诱导形成胸腺嘧啶二聚体和DNA交联，从而抑制DNA的复制。此外，细菌具有光复合效应。紫外线穿透力弱，加一张蜡光纸即可阻止其穿过。

在自然界中普遍存在微生物间的拮抗现象，许多微生物可以产生抗生素，能选择性地抑制或杀死其他微生物。

常用化学消毒剂包括有机溶剂（酚、醇、醛等）、重金属、卤素元素及其化合物、染料和表面活性剂。有机溶剂使蛋白质（酶）和核酸变性失活，破坏细胞膜；重金属盐也可使使蛋白质（酶）和核酸变性失活，或与细胞代谢产物螯合使之变成无效化合物；碘与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活；低浓度染料可抑制细菌生长，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对染料更加敏感。

影响微生物生长的外界因素很多，其一是前面讨论过的营养物质，其二是许多物理、化学因素。当环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；当环境条件的变化超过一定极限时，则导致微生物的死亡。研究环境条件与微生物之间的相互关系，有助于了解微生物在自然界的分布与作用，也可指导人们在食品加工中有效地控制微生物的生命活动，保证食品的安全性，延长食品的货架期。

（二）革

兰

氏

染

色

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏阴性菌，以[大肠杆菌]为代表。大肠杆菌为兼气性菌种，一般生存於肠道中及厌氧的还境中。革兰氏阴性菌细胞壁的特徵为有一层out member 与阳性菌种不同。目前对大肠杆菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指标外，很多分子生物学方面的研究皆需要使用到大肠杆菌当作实验宿主。

临床应用：用于革兰氏细菌分类形态观察前的染色。主要应用于细菌分类和鉴定，革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。

适用范围：适宜石蜡切片、涂片等染色。

（三）活菌计数

菌计数法

此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。将待测样品经一系列 10 倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取 0.2ml 放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷至 45 ℃ 左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数：

每毫升原菌液活菌数＝同一稀释度三个以上重复平皿

菌落平均数×稀释倍数× 5

此法还可以将稀释的菌液取 0.2m 1 加到已制备好的平板上，然后用无菌涂棒将菌液涂布整个平板表面，放入适宜温度下培养，计算菌落数，再按上公式计算出每毫升原菌液的所含活菌总数。此法可因操作不熟练造成污染，或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。尽管如此，由于该方法能测出样品中微量的菌数，仍是教学、科研和生产上常用的一种测定细菌数的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽抱与抱子等的数量均可用此法测定。但不适于测定样品中丝状体微生物，例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等。

随着微生态学的发展，微生态疗法通过调整肠道菌群作为部分疾病的辅助治疗已应用于临床。粪便标本肠道菌群的定量检测方法——平板活菌计数法能够较好地判定其疗效以及肠道菌群是否存在失调和失调的程度。此种方法计数的线性范围大，能较好的反映菌落的疏密程度。重复性、平行性好，但操作较繁琐，且测定值常受各种因素的影响，需要操作者有熟练的技术。

在同学们的相互配合和老师的耐心指导下，这门实验课也接近了尾声，在这一学的这门实验课中我也学到了很多的实验室知识。为了保证实验过程高质高量完成，除了实验准备及实验过程外，还要求实验技术人员必须具备相应的素质，实验操作人员必须具备较扎实的专业基础、熟练的实验技能及高度的责任心，在工作中要善于总结，同时一定要和老师积极沟通，不懂得地方及时向他请教，在以后的学习和工作中，我会继续保持这种态度，认真完成老师交给的各项任务。

水及食品中微生物的检测(实验报告 篇三

水及食品中微生物的检测

××××××××××

食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。它不仅是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类，动物和食物中毒的防治措施[1]。食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。

水是食品生产中的重要原料，必须符合饮用水的标准、水是否合乎标准，除需对其感官质量、放射性物质、与健康有关的无机成分等进行分析测定外，还必须对微生物进行检测。通常通过水中细菌总数和大肠杆菌群数来确定水的卫生质量，如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染而引起伤寒、痢疾、霍乱等肠道疾病的流行，但肠道病原菌在水中数量较少，又容易变异死亡。因此，从水中特别是自来水中分离病原菌有困难。而大肠杆菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一种，所以，常将其作为粪便污染的标志，即根据水中大肠杆菌的数目来判断水源是否被污染，并间接测水源受肠道病原菌污染的可能性。一般规定，1ml自来水总的总菌数不得超过100个；每1000ml自来水中大肠菌群不超过3个。同样，细菌总数和大肠菌群数也是大多数食品微生物指标中的两项指标，只是数量要求随不同的食品而异。

细菌总数是指被检样品经过处理（如剪碎、研匀），在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。由于一个活细胞能形成一个菌落，因此，菌落就是待测样品所含的活菌数。由于每种细菌都有一定的生理要求（如对氧、培养温度、培养基的pH等），所以，培养时应该用不同的培养条件及不同的生理条件去满足其要求，才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作细菌菌落总数的测定，所得结果指包括一群能在牛肉膏蛋白胨琼脂上或其他培养基上生长的嗜中温性需氧菌的菌落总数。本实验通过取样对自来水和黄酒中的微生物进行了检测，以期了解该两样样品中微生物含量是否符合饮用标准，并熟悉水及食品中微生物的检测方法。

食品在食用前的各个环节中，被微生物污染往往是不可避免的。评价食品被微生物污染的程度，要采用微生物检验指标采进行。常采用的微生物检验指标为三项细菌指标，即细菌

数量（主要是菌落总数）、大肠菌群最近似数（MPN）和致病菌[2]。

1、材料与方法

1.1材料

湖水、黄酒

1.2培养基

肉膏蛋白胨琼脂培养基；乳糖胆盐发酵培养基；伊红美蓝固体培养基；乳糖发酵培养基；

1.3仪器

恒温培养箱（温州康鼎净化工程有限公司）；超净工作台（苏州宏瑞净化科技有限公司）；蒸汽式高压灭菌锅（诸城市永泰机械有限公司）。

1.4细菌总数的测定

1.4.1采样

瓶装发酵酒的取样：用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器将瓶启开，倒入500ml灭菌磨口瓶中，覆盖一灭菌纱布，轻轻震荡使气体逸出，待检。

湖水的取样：将无菌带玻璃塞的广口瓶浸入离湖面10-15cm水下，盛满后将瓶口盖好，再从水中取出，待检或保存于4℃冰箱保存。1.4.2检样稀释

将1ml待测液加入含9ml无菌水的试管中，制成10-1稀释液，再吸取1ml稀释液加入到含含9ml无菌水的试管中，制成10-2稀释液，同法，配制稀释度为10-

3、10-

4、10-5的稀释液。1.4.3倾注培养

选择10-4和10-5两个稀释液，分别取1ml于平皿内，及时倒入约45℃肉膏蛋白胨琼脂培养基约15ml，摇动混匀，待凝固后将平皿倒置于36±1℃的恒温箱内培养24±2h后取出，计算平板内菌落总数。

1.5大肠菌群检验

1.5.1 检样稀释

将1ml待测液加入含9ml无菌水的试管中，制成10-1稀释液，再吸取1ml稀释液加入到含含9ml无菌水的试管中，制成10-2稀释液。1.5.2乳糖胆盐发酵

分别取1、10-

1、10-2稀释液1ml注入乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种3管，于36±1℃的恒温箱里倒置培养24±2h，如乳糖胆盐发酵管不产气则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。1.5.3分离培养

将产气的发酵管分别接种于伊红美蓝琼脂平板上，于36±1℃恒温箱倒置培养18-24h。观察菌落形态，做革兰氏染色和复发酵证实实验。1.5.4复发酵证实实验

在伊红美蓝琼脂平板上挑取：①紫红色，具有金属光泽的菌落；②深红色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡红色，中心较深的菌落。具有以上特征的菌落均为可疑大肠杆群菌落，挑取1-2个进行革兰氏染色，同时对应接种到乳糖发酵管内进行复发酵，于36±1℃的恒温箱倒置培养24±2h，观察产气情况。凡在乳糖发酵管内产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性；如不产气或革兰氏阳性，则可报告大肠军群阴性。

2结果与分析

2.1细菌总数

表1 湖水的细菌总数测定结果

样品 1 2 平均菌落数 菌落总数（个/ml)

取湖水、黄酒稀释度为10-4和10-5的稀释液于牛肉膏蛋白胨培养基内混合培养，每一稀释度2个平板。将平皿倒置于36±1℃的恒温箱内培养24±2h后取出，采用肉眼直接观察计数各平板的菌落数，并计算两者的菌落数，结果如表1所示。

由表可知湖水的细菌含量为1.25*105个/ml，比黄酒的细菌含量高。查阅资料得，1ml自来水的总菌数不得超过100个，本实验所测的样品湖水和黄酒中的菌落总数均超过100个，所以细菌都超标，不符合安全标准。

湖水10-4 12 13 12.5

1.3×105

湖水10-55 5

黄酒10-4

0 0 0

<1×104

黄酒10-5

0 0 0

2.2大肠菌群检验结果

表2 湖水及黄酒的大肠菌群检验的结果

伊红美篮平板上

稀释度 管号 乳糖胆盐发酵

有无可疑菌落

1003 1

10-13 1

10-23

分别取黄酒和湖水1、10-

1、10-2稀释液1ml注入乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种3管，进行乳糖胆盐发酵的实验。结果如表2所示。湖水的三个稀释度的九只试管中大肠菌群均为阳性，即都含有大肠杆菌。而黄酒的三个稀释度的九只试管中大肠菌群均为阴性。查MPN检索表可得出每100ml湖水中大肠菌群最可能数>2400个，每100ml黄酒中大肠菌群最可能数<30个。这表明了湖水中大肠杆菌含量较高，而黄酒中大肠杆菌含量较低。

无气泡

无

红色

无气泡 大肠杆菌群阴性

无气泡

无

红色

无气泡 大肠杆菌群阴性

无气泡

无

红色

无气泡 大肠杆菌群阴性

革兰氏染色 复发酵

结论

3讨论

食品中的微生物有许多种类，有的可导致人类产生疾病，有的对人类无害，也有的可产生一些不能令人忽视的代谢产物，因此食品中的微生物，尤其是一些致病微生物常常是作为人类是否能够食用该食品的重要指标。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，可导致人类感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染致病微生物的可能。一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导致食源性感染和食物中毒，对人们的危害极大，快速检验方法是社会的迫切需要。

参考文献 ：

[1] 龙夫。食品微生物快速检测技术动向[J]。食品安全， 2004, 6:55-56

[2] 陈庆森， 冯永强。食品中致病菌的快速检测技术的研究现状与进展[J]。食品科学， 2003, 24(11): 148-152

临床微生物标本检测和细菌耐药监测 篇四

红河州第四人民医院

临床微生物标本检测和细菌耐药监测制度

1、根据临床微生物标本检测结果合理选用抗菌药物，接受抗菌药物治疗住院患者微生物检验样本送检率不低于30%（相关指标计算方式见附件5）。

2、感染管理部门应对本院细菌耐药情况进行监测，每三个月定期分析、评估监测数据并发布相关信息，提出干预和改进措施，建立细菌耐药预警机制，配合医务部门监督实施。

3、医疗机构抗菌药物管理工作组针对不同的细菌耐药水平必须采取相应应对措施。

（1）对主要目标细菌耐药率超过30％的抗菌药物，及时将预警信息通报医务人员。

（2）对主要目标细菌耐药率超过40％的抗菌药物，慎重经验用药。(3)对主要目标细菌耐药率超过50％的抗菌药物，参照药敏试验结果选用。

（4）对主要目标细菌耐药率超过75％的抗菌药物，暂停临床应用，根据追踪细菌耐药监测结果，再决定是否恢复临床应用。

4、抗菌药物管理工作组按照要求向全国抗菌药物临床应用监测网报送抗菌药物临床应用相关数据信息，向全国细菌耐药监测网报送耐药菌分布和耐药情况等相关信息。

5、药事管理委员会应根据本院微生物培养、药敏情况，定期进行抗菌药物淘汰或筛选，定期对抗菌药物目录进行调整。

红河州第四人民医院药事管理委员会、药剂科

2011年7月1日

微生物分离实验报告（定稿 篇五

微生物分离实验报告

实验仪器及材料

土样：18号土样 试剂及培养基

培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分

离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基

a)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%

乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等

仪器

锥形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培养皿（20套）、试管（20支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等

细菌的筛选，分离纯化及鉴定 细菌的筛选

土样处理

配制生理盐水：在烧杯中配置200ml0.85％的生理盐水，用移液管各移取9ml于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶，并放入少许玻璃珠，包好灭菌；

加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀，然后放在30℃恒温培养箱中静置15min。

果胶酶菌种筛选

梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-

2、10-3两种稀释度的土壤溶液（如下图）；

涂布：配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上10-

1、10-3两种稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由10-

3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入0.2ml，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；

培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；

果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿，用0.5％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；

菌落描述：取此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录； 细菌的分离纯化

划线分离：制备果胶酶划线培养基，灭菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌种，第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不

图 细菌的划线分离示意图

能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；

纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基，分装试管后灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定。

a)纯种果胶酶水解能力的测定

配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，将分离纯化的细菌点种于平板上（注意：点种的量不宜过多，以3～4个为宜），在30℃培养箱中培养1～2天，取培养后的平皿用0.5％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，测量并记录透明圈的大小

b)简单染色步骤 i.涂片 取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）

ii.干燥与固定

涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；

iii.染色

将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min iv.水洗

倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；

v.干燥

用吸水纸吸去多余水分后自然干燥； vi.镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。

c)革兰氏染色步骤 i.涂片

先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水。分别取四种活跃生长期菌种（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和一种自选菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。

ii.初染

滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min后水洗； iii.媒染

先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗； iv.脱色

先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗；

v.复染

先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染1.5min后水洗； vi.镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果。

d)芽孢染色步骤 i.涂片，加热干燥及固定

在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。然后按照常规方法加热干燥及固定；

ii.孔雀绿加热染色

用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；

iii.水洗

水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。具体水洗按常规方法进行； iv.复染

用0.5%番红水溶液复染2min； v.水洗并干燥

按常规方法水洗后自然干燥； vi.镜检

先在低倍镜下寻找视野范围，然后换用高倍镜调焦，最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。

e)半固体穿刺法观察细菌运动性 i.配制培养基

配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于4支试管内，110度灭菌20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温；

ii.在无菌操作台上右手握接种针，以针挑取菌苔。垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近（但勿触及）试管底，然后循原路退出。如图所示：

iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性。

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